1． DNA来源的影响 限制性内切酶的单位定义是以λ嗜菌体DNA作为底物进行测定的，所得数据并不能说明对于其它来源的DNA也会产生同样的效果。因为酶的活性还依赖于DNA的线性和盘绕结构、识别位点的频率、位点两侧的序列。因此遇到消化不彻底等情况，最好先查清该酶对特定底物的作用再作调整。
2． DNA纯度的影响 DNA的制备，尤其是少量制备，经常可能包含了许多污染物，如酚、氯仿、醇、去垢剂、EDTA、钠盐等。这些均可能部分或全部地抑制了酶的活力，出现酶消化不充分的情况。可以将样本与λ嗜菌体DNA并列作一次实验，如果单独的λ嗜菌体DNA样品消化正常，而混合样品不正常，则必须重新纯化样品。
3． 对甲基化的敏感性 每一种限制性内切酶对甲基化均有一定的敏感性，识别位点上的甲基化有时部分甚至全部抑制了酶的活性。实验室常用的Ecoli经常会包含dam和dcm两种甲基化，特别是在CG和C上容易产生甲基化，如果出现不充分消化，应该检查是否选用了对甲基化敏感的酶。
4． 反应条件是否合适 限制性内切酶的活性较大的依赖于以下几个因素：孵育的温度、离子强度、pH、Mg2+浓度等。有时BSA的存在对酶的活性起至关重要的作用，因为BSA能结合掉一些杂质，防止酶被试管壁吸附，使酶更稳定，所以尽可能采用生产商提供的反应条件和反应缓冲液。有时候酶的活性下降是由于反应缓冲液造成的，应当根据生产商提供的配方重新配制缓冲液。
5． 不恰当的稀释和加入酶 为了得到正确的浓度，经常需要对酶进行稀释，我们推荐如下稀释液配方：20mM KPO4(pH7.0), 1mM EDTA, 7mM β–巯基乙醇，10%甘油，0.2ng/ml的BSA，被稀释的酶尽可能在一天内用完。直接采用反应缓冲液稀释可能会抑制酶的活性，因为反应缓冲液的离子强度较低及缺少稳定剂。一般限制性内切酶应在反应的最后一步加入。
6． 甘油的浓度 有些限制性内切酶，如NcoⅠ，BspⅠ，HpaⅠ等，在反应中对甘油的浓度非常敏感，如果所提供的酶含有50%的甘油，应当使反应的甘油终浓度小于5%，否则会抑制酶的活性。
7． 不完全消化 在辨别一些不完全消化的产物时，有时会遇到一些困难，因为部分消化的条带微弱，比正常带的位置要高，而在正常位置不出现或出现微弱的条带，或在预期出现的最低位置没有出现条带，这可以通过延长孵育时间和增加酶的用量来使其消化完全。
8． 非特异性切割 有些内切酶在某些情况下，特异性下降，切割除识别位点以外的位点，这种情况引起的条带一般要比正常的条带位置低，比预期出现的最高位置的条带也要低，如果延长孵育时间或增加酶量会加重这种情况。解决的方法是用酶尽量不要过量，采用生产商提供的反应缓冲液，降低甘油浓度，可能会改善特异性的情况。
9． 其它内切酶的污染 如果以上原因均排除了，仍有不正常条带出现，尤其是小的条带出现，除现存不正确的操作外，可能还存在其它内切酶的污染，这种污染往往不是内切酶本身，而是反应缓冲液、终止液或在DNA制备过程中带入的。
10． 出现弥散的条带 a.检查制备的DNA是否足够纯，可以不加内切酶或其它内切酶试验；b.根据生产商指定的标准底物进行酶切对照，是否出现正常的条带；c.有时由于某些蛋白与DNA结合导致此现象，可以在电泳上样前加0.1%的SDS（终浓度）65℃保温10min来消除此现象。
11． 酶切片断的联接效率低 a.联接缓冲液中含有ATP和DTT容易降解，会影响联接的效率，应重新配制联接缓冲液；b.内切酶的活性仍存在，如果反应液中的内切酶在65℃没有完全灭活，会造成联接效率低，可以提供重新灭活或酚抽提或乙醇沉淀的方法来解决；c.内切酶、联接酶、DNA制备中的不正确操作，可能会带入非特异性的核酸酶，造成联接效率低，应将这些可能一一排除；d.联接酶的浓度太低，在平端联接中联接酶的浓度应在100-500u/ml左右，有些内切酶如BcnⅠ、Bsp68Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco72Ⅰ、Eco8Ⅰ、MvaⅠ等酶切后联接效率非常低，最好采用高浓度的联接酶（20-40u/ug DNA片断）和10%的PEG，酶切后最好重新纯化后再联接。