细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。

 

Protocal:

 

1.        悬浮细胞：离心后计数细胞，根据细胞增殖速度，加入新鲜完全培养基，制成适当密度后，放入新瓶培养：快速增殖的肿瘤细胞系，可调节密度为1×10⁴细胞/ml至1×10⁵细胞/ml，对增殖缓慢细胞可加大密度。

2.        贴壁细胞：吸弃培养基，用PBS洗一遍，沿培养瓶侧壁加入2-3ml新鲜配制的胰酶（浓度为0.2-0.3%，以PBS配制后过滤除菌），完全覆盖全部细胞层，室温静置1分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，镜下观察，当细胞开始变圆但尚末完全脱落时（一需3-15分钟不等，依各细胞类型而定）立即加入2-3 ml带血清的培养基，中止胰酶消化，对着培养瓶底角充分吹打细胞，使成单细胞，计数细胞，按所需密度传代，一瓶生长密集的细胞可传代3-6瓶。

 

注：

 

1.        一般传代后24小时左右，细胞进入指数生长期，是良好的实验材料。

2.        贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。

3.        如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异；

4.        有些肿瘤细胞需体内传代，即接种动物体内传代。对这些细胞株应避免在体外过多传代，如体外培养，应在10代以内使用。