胚胎干细胞

胚胎干细胞（ES）的特性由它的起源所决定。它起源于囊胚期，即着床前的胚胎发育阶段。小鼠的囊胚含150个细胞，由三部分构成，即：排列成球壳状的外层细胞（滋养层），一个含液腔（囊胚腔）和一簇附于球内壁的细胞（内细胞团）。

　20年前细胞实验室培养技术的创立，使对小鼠囊胚源ES细胞的研究成为可能。胚胎样干细胞，又称胚胎样生殖细胞（embryonic germ cell，EG cell），也可以由人[30]或小鼠[20]的原始生殖细胞（primordial germ cell，PG cell），即发育胎儿中的胚细胞发育而来。

　本章主要讨论小鼠胚胎干细胞，人胚胎干细胞将在第三章中讨论。

胚胎干细胞确实发生于胚胎吗？

　一些科研人员认为ES细胞并非发生于胚胎，ES细胞与着床前的胚胎非常相似[3]，但实际上并不相同[32]。另一种观点是：许多哺乳动物的胚胎中都含有干细胞，这些细胞在胚胎中广泛增殖，并可以发育成成体中所有类别的细胞。我们可以对这些细胞进行分离和体外培养，它们能够在体外继续增殖并显示出分化潜能[18]。

　如果为研究目的，ES细胞仅仅被定义为"起源于胚胎，有自我复制能力并可以分化为所有种类体细胞的一种干细胞"是不够的。研究者认为，创立一个特殊标准以助更好的定义ES细胞是必要的。Austin Smith对鼠ES细胞的研究在这一领域有卓越贡献，他提出了可以定义ES细胞的一些基本特征[18，32]。

胚胎干细胞的定义性特征

· a起源于囊胚的内细胞团。

· a可以无限地对称分裂并保持未分化状态（长期自我更新）。

· 显示并维持染色体（核型）的稳定和二倍体完整性。

· 多能ES细胞可以产生来自内，中，外三个原始胚层的全部分化细胞型。

· a，b可以在发育过程中整合为全部胚胎组织。（为了产生嵌合体，将体外长期保存的小鼠ES细胞重新导入胚胎后，仍可以产生全部类型的组织。）

· a，b可以占据种系（germ line）并产生卵细胞或精细胞。

· a，从克隆发生上来讲，单一的ES 细胞就可以产生一系遗传学上完全相同的细胞或克隆，而且它们的特性与起源细胞相同。

· 表达细胞因子Oct-4，Oct-4可以激活或抑制大量靶基因，并使ES细胞维持一种非分化增殖状态。

· 可以诱导之进行增殖或分化。

· 其细胞周期缺如G1检验点。ES细胞的细胞周期大部分为S期，此期合成DNA。与已分化的体细胞不同：ES细胞不需要任何外来刺激来启动DNA复制。

· 不表现X失活。在雌性哺乳动物的任一体细胞中，二个X染色体中的一个都会永久性失活。而X失活在ERS细胞中并不发生。

[ a 在人胚胎生殖细胞中不表现。b在人ES细胞中不表现。上述标准适用于鼠ES细胞]

胚胎干细胞确实是多潜能的吗？

　多潜能-----产生来自内，中，外三胚层的所有类型分化细胞的能力-----是可以用来定义ES细胞的一种特性。我们如何才能知道ES细胞是否是多潜能的呢？检验小鼠ES细胞多潜能性的实验室标准包括三种实验。一种是将来自一种囊胚内细胞团的ES细胞注射入另一个囊胚腔。然后将这种"组合"的胚胎转移至一只假孕雌鼠的子宫。由此得到的后代是一种嵌合体，即发源于供者ES细胞和受者囊胚的组织器官细胞的混合体。

　现在已经能够利用着项技术来检验，培养的ES细胞是否可以取代鼠囊胚的内细胞团，并发育为正常胚胎。实验证明，答案是肯定的，但这种过程的效率不及直接采用囊胚内细胞团来发育胚胎的方法。显然，ES细胞产生完整胚胎的能力取决于它们在体外的传代数[21，22]。传代就是将所培育的细胞从一个培养皿转移至另一新鲜培养皿继续增殖的过程。传代数是否影响人ES细胞的分化潜能还有待研究。（培养小鼠ES细胞技术的详细阐述参见附录B，鼠胚胎干细胞）

　第二种检验小鼠ES细胞多能性的方法是将其注射入遗传学上相同或免疫缺欠的成年小鼠（皮下注射或注射入肾囊），这样注射入的组织就不会被排斥。在宿主动物中，注入的ES细胞发育成了一种良性肿瘤-------畸胎瘤。显微镜下观察发现，畸胎瘤含有起源于内中外三胚层的各型细胞。典型的畸胎瘤含有肠样组织如上皮细胞和平滑肌，骨骼肌或心肌（能够自律性收缩），神经组织，软骨组织或骨组织，有时还有毛发。因此，体外长期培养的ES细胞在活体环境中可表现出多潜能性。他们既可以通过发育为身体的任一种细胞来参与正常胚胎发育，也可以发育为动物成体中广泛类型的细胞。然而正常的小鼠ES细胞并不会在活体条件下产生滋养层组织[32]。

　第三种演示多能性的技术是让体外培养的小鼠ES细胞自发分化或诱导它们沿特定的方向分化。前者可以通过移除培养基支持层（feeder layer）并加入白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）来完成。改变培养基成分后的几天内，ES细胞就聚集并形成胚样体（embryoid bodies，EBs）。培养皿中的EBs细胞在好多方面都类似于哺乳动物的畸胎瘤。EBs由来自内中外三个胚层的已分化或部分分化的细胞无秩序地排列而成[32]。

　源于着床前囊胚内细胞团的小鼠ES细胞的培养技术于20年前第一次被报导[9，19]，如今，这种标准技术的不同版本已在世界范围内广泛应用。另人吃惊的是，到目前为止，只发现三种哺乳动物能够产生可长期培养的自我更新的ES细胞，即小鼠，猴和人类[27，34，35，36]（参见附录B，"鼠胚胎干细胞"）。

小鼠ES细胞是如何保持未分化状态的？

如前所述，真正的干细胞是能够以一种自我更新的未分化状态来无限地保持自我的。ES细胞的这种未分化状态，有着特殊的细胞标志。这种标志物有助于科研人员更好地理解适当培养条件下的ES细胞是如何上百代地复制同时又保持不分化的。目前，主要由以下两个领域的研究为此提供了线索。一种是研究分泌因子的作用，如细胞因子LIF对体外培养的鼠ES细胞的影响。另一领域研究转录因子如Oct-4的作用。Oct-4是由体外培养的人或鼠ES细胞分泌的一种蛋白，它也可以由活体鼠内细胞团分泌。另外，ES的细胞周期也会对分化产生抑制作用。对这些信号途径的研究表明，只有当这些因子处于一种特定的平衡状态时，ES细胞才会保持一种未分化的自我更新状态。一旦平衡移动了，ES细胞就会开始分化[18，31]。（关于ES细胞如何保持多能性的详细论述参见附录B，"鼠胚胎干细胞"）

可以在体外诱导小鼠ES细胞分化为一种特殊类型的细胞吗？

　研究胚胎干细胞的一个目标是培育特化的细胞，如神经元，心肌细胞，内皮细胞和类似于在胰腺中发现的胰岛分泌细胞。ES细胞的定向诱导对于这种细胞在新疗法中的应用是至关重要的。

　目前，诱导定向分化的最常用方法是，以特定方式更换ES细胞的生长条件，比如在培养基中加入生长因子或改变ES所附着的表面成分。例如，用来培养鼠或人ES细胞的塑料培养皿可以用各种不同的底物处理，而这些底物或是允许细胞贴壁生长，或是使之不能贴壁而悬浮于培养液中。总的来说，使细胞贴壁的粘附物质可以阻止细胞相互作用而分化；反之，非粘附物质则允许干细胞聚集并相互作用进而分化。细胞间相互作用是正常胚胎发育的关键条件，所以体外诱导鼠或人ES细胞分化的一项基本策略就是在培养皿中模拟体内自然的胞间相互作用。另外，在培养基中加入特定的生长因子，可以激活ES细胞的特定基因；这就引发了一系列分子事件从而诱导细胞沿特定路径分化。

　诱导ES细胞分化的另一途径是利用转染或其他方法[6，39]向干细胞中引入异体基因。这样，就会在ES细胞基因组中加入一个可以引发干细胞定向分化的活性基因。这种技术看起来是调节ES分化的有效方法，但只有确切弄清哪个基因在应在分化的哪个阶段活化，它才真正行之有效；即所插入的基因必须在正确的时期即分化的适当阶段活化，而且必须插入在基因组中的正确位置。

　产生鼠ES细胞，还有一种方法就是克隆技术的应用。理论上，一个已分化鼠体细胞的细胞核，当把它注射到卵母细胞中时可以重新"编程"。这样所得到的多能细胞，在免疫学上与供者相容，因为它与供体细胞在遗传学上是相同的。

　尽管上述技术依然处于实验阶段，但近几年人们已经能够通过体外控制鼠ES细胞的生长条件来制造特化的功能细胞了。然而，人们现在还无法解释这种诱导下的分化是如何发生的。基因表达在何时是如何改变的；哪一个信号转导系统被激活；哪种必须的胞间作用使未分化的ES细胞转化为前体细胞并最终变为分化完全的细胞，而且在外形与功能上都类似于它们在体内的相应细胞，这些都是不得而知的。

　已有证据表明，ES细胞可以分化为许多细胞型。例如，可以体外诱导ES细胞发育为血管组织[40]，分泌多巴胺和血清素的神经元和胰岛内分泌细胞。在这三种情况中，增殖的、未分化的鼠ES细胞均可产生起始物质进而转变为特化的多功能细胞。我们也可以通过去除培养基中的LIF来触发鼠ES细胞的分化；而LIF则可以促进鼠ES细胞在不分化状态下进行分裂。在诱导分化时,ES细胞会发生聚集，这是一种三维环境的改变；也许正是这种改变使一些在正常活体胚胎中的胞间联系得以在体外发生。

　总的来说，这三项研究为诱导分化的ES细胞提供了最佳的证据。其中两项表明单个的前体细胞就可以产生多种分化的细胞型[16，40]。这三项研究又全部表明由ES诱导出来的分化细胞的功能与活体中的相应细胞是相同的。而这两项标准------- 一是演示单个ES细胞可以产生多种细胞类型；二是所得分化细胞的功能特性------- 则形成了酸性实验的理论基础。这种实验用来检验那些所谓对人或鼠ES细胞的诱导分化是否成功。遗憾的是，仅有少数实验的结果符合这两项标准，以至于我们常常无法评价一种分化的细胞型是否是由所报道的实验得到的。（诱导鼠ES细胞分化实验技术的详细讨论见附录B "鼠胚胎干细胞"。）

表2-1总结了目前可以由鼠ES细胞诱导而来的分化细胞类型。

表2-1已报道的鼠ES细胞体外诱导分化细胞类型。

细胞类型参考索引

脂肪细胞 [7]

星形细胞 [11]

心肌细胞 [8，17]

软骨细胞 [13]

终末造血细胞 [23，24，38]

树突状细胞 [10]

内皮细胞 [28，40]

角质细胞 [1，40]

淋巴前体细胞 [26]

肥大细胞 [37]

神经元 [2，33]

少突细胞 [4，15]

成骨细胞 [5]

胰岛分泌细胞 [16]

原始造血细胞 [8，23]

平滑肌 [40]

横纹肌 [29]

卵黄囊内胚层 [8]

卵黄囊中胚层 [8]

*经参考文献[32]允许作了调整

参考文献

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（吉林大学唐蕾蕾译）