反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒*（论文）

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒*

广东省防治非典型肺炎科技攻关病原分离组

王艳^１马文丽^１宋艳斌¹ 肖维威¹ 张宝¹ 黄海¹ 王洪敏¹ 马晓冬¹ 郑文岭²

¹第一军医大学全军生物芯片重点实验室，中国人民解放军基因工程研究所（广州 510515）;

² 广州军区广州总医院医学实验科(广州 510010)

【摘要】目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA, 用巢式PCR外侧下游引物进行反转录，以反转录产物为模板，进行巢式第1次、第2次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段，经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列，证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。

【关键词】 SARS冠状病毒反转录巢式PCR

Gene sequence analysis of SARS-associated coronavirus by nested RT-PCR Wang Yan, Ma Wenli, Song Yanbin, et al. Institute of Genetic Engineering, First Military Medical University, Guangzhou 510515

【Abstract】 Objective To explore the effective assay of SARS-associated coronavirus as well as the diagnosis of SARS (severe acute respiratory syndrome). Methods RNAs of clinical samples from Beijing were extracted and reversed transcripted by out antisense primer, then a nested PCR was performed using the reversed transcripted cDNA as the template. PCR products were cloned into the pMD18-T vectors, followed by sequencing. Results Specific fragments were amplified in clinical samp les of SARS patients and confirmed by DNA cloning and sequencing. Result of blast showed only one nucleic acid different from TOR2 strain of SARS-associated coronavirus.Conclusion Sequencing confirm the existence of SARS-associated coronavirus sequence. Nest RT-PCR could be a quick, easy, and convenient way of detecting SARS-associated coronavirus.

【Key words】 SARS-associated coronavirus Nested RT-PC R

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS) 又称非典型性肺炎，该病传播迅速，发病凶险。据WHO官方网站统计数据，截止2003年5月5日全世界共有29个国家和地区发现SARS，累计病例6 583例，死亡461例。为遏制其继续蔓延发展，对SARS病毒携带者必须实行严格积极的隔离措施，另外尽早确诊能极大提高治愈率。因此要求对病原体要做出快速、准确的早期检测。

经世界各国通力合作，目前已初步认定SARS病原体是冠状病毒的新变种^［1,2］，该病毒为正链RNA病毒，长度近30kb。加拿大和美国已率先完成SARS病毒的基因组测序^［3］。对于RNA病毒直接取用临床样品进行检测具有一定难度，本研究采取反转录巢式PCR 方法对临床样品进行检测，提高了反应灵敏度，扩增产物特异性很高，初步证明该法为一种有效的SARS早期诊断方法。研究验证了在SARS病人体内存在与SARS相关的冠状病毒的基因组序列。

1 材料与方法

1.1 样品

标本取自北京302医院2003年1月至4月非典型肺炎的患者，共6例。取痰液或咽拭子，离心取上清，-80⁰C保存备用。对照样品为正常人唾液。

1.2 引物

根据加拿大公布SARS冠状病毒多伦多株的nsp11基因序列设计的引物，由博亚公司合成，外侧引物①：5′-ATGAATTACCAAGTCAATGGTTAC-3′；

外侧引物②：5′-GAAGCTATTCGTCACGTTCG-3′；

内侧引物③：5′-CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG-3′；

内侧引物④：5′-CATAACCATCGGTACAGCTAC-3′。巢式PCR扩增片段长度为109bp。

1.3 病毒RNA提取

样品加等体积水饱和酚混匀，65⁰C加热10min后加1/2体积氯仿抽提，取上清加1/10体积pH5.2的3mol/L NaAc, 2倍体积无水乙醇于-80 ⁰C沉淀30 min，4 ⁰C离心沉淀，70％乙醇洗涤后干燥，加DEPC水溶解。

1.4 反转录合成第一链

加上述制备的RNA 5μl，10mmol/L dNTP 5μl, Rnase inhibitor 2.5μl, 引物②5μl，反转录酶SuperScriptII2.5μl, 加DEPC处理水至50μl总体积。42 ⁰C反应50min。

1.5 巢式PCR 第1次PCR

加上述制备的第一链模板DNA 5μl，引物①，②各1μl, 2×PCR反应混合液10μl ，加水至总体积20μl。94⁰C预变性5min，94⁰C变性30s，55 ⁰C退火30s，72⁰C延伸30s，循环30次。第2次PCR：取第1次PCR产物1μl做模板，用引物③，④进行扩增，条件同前。

1.6 PCR产物克隆

取经过切胶纯化后的PCR产物4.5μl，pMD18-T载体0.5μl，连接液solutionI5μl,总体积10μl, 16℃反应2h。连接产物全量转化XL-I宿主菌。

1.7 测序挑取阳性克隆鉴定, 提取质粒,由本室完成测序。

1.8 测序结果去除载体序列，取28～137bp段进行Blast序列比较。

2 结果

2.1 反转录巢式PCR电泳图见图1。

图1 反转录巢式PCR鉴定临床样品扩增产物

2.2 测序结果图

将反转录PCR电泳的条带自琼脂糖凝胶中切割下来，经TA克隆和转化，通过阳性克隆质粒的提取，进行DNA序列分析。DNA序列分析结果如图2所示。可见DNA序列图谱清晰，可读性强。其不仅可读出nested RT-PCR插入的条带，而且两侧的PCR引物及载体序列亦被测出，证明了系统的确切性。将DNA测序结果进行BLAST分析，可见该扩增出的序列与SARS相关的冠状病毒具有高度同源性。

图2 反转录巢式PCR片段克隆测序图

2.3 BLAST结果

Blast 结果显示该片段序列与下述已测序的9株SARS冠状病毒的相应序列几乎完全一致，以多伦多株TOR2（序列号：gi|30088476|gb|AY274119.2|）为例，仅有一个碱基的差异：

3 讨论

人口流动性大、相当数量潜伏期病毒携带者的存在、一些地区医疗条件恶劣以及对SARS了解的缺乏，导致疫情的控制变得非常困难。现在SARS病例每天仍在增加，人类生命健康受到严重威胁^［4,5］。该病潜伏期短，发病急，早期快速、准确诊断以实施隔离和治疗措施极其重要。据互联网上公布资料，目前SARS仍然主要依赖于对临床症状进行诊断，但已有部分国家和地区已经开始了实验室诊断，包括免疫酶联法、免疫荧光分析法及PCR法^［6,7］。免疫酶联法通常要在临床症状出现20d后才能检测到抗体，因此该法不适用于疾病发生早期的检测以及疾病传播的控制。免疫荧光分析法在感染10d后就能探测到抗体并且结果可信，但是其要求较高且较费时，因为病毒在细胞培养基上的生长需要一定的时间。PCR分子检测SARS病毒基因的方法在感染早期即可行，但临床样品成分复杂给PCR检测带来难度，可能产生假阴性结果，即病毒携带者可能不会被检测出来，而SARS是人群密切接触传播的，假阴性将带来错误的安全信息。

本研究采用反转录巢式PCR方法对来自北京的临床样品进行检测，通过外侧及内侧引物两次扩增，提高了检测的灵敏度，一定程度上克服了假阴性的问题，同时也增加了PCR反应的特异性及严格性，降低了假阳性。临床病例样品中均扩增出特异片段，而在正常人样品中无特异性扩增。扩增片段测序后经Blast序列比较，与多伦多分离株的序列仅有一个碱基不同，证实确系SARS冠状病毒基因。本法无需对病毒进行分离培养，检测灵敏度高且方便易行，从模板制备到获得鉴定结果只需4h。在非典型性肺炎的早期诊断中具有重要价值，可直接应用于临床检验。

本研究中采用的临床样品还有待于补充增加，今后将进一步扩大收集范围，以验证该法的可行性。另外，由于冠状病毒的广泛存在，虽然我们在患者体内扩增出与SARS相关的冠状病毒序列，但并不能确认我们所检测的非典型肺炎患者确实是由SARS相关冠状病毒所致病。在患者体内普遍检出的冠状病毒是否为“过路”或“伴随病原体”，其确切的病原学与病因学分析，还有赖于动物实验疾病模型的复制和有效疫苗的应用。

(致谢：感谢北京302医院提供样品，感谢本室郭秋野老师、石嵘同学在取样方面所做的工作。)

(本文已发表于《第一军医大学学报》第23卷第5期)

参考文献

1 Peiris J, Lai S, Poon L, et al. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003, 361(9366): 1319

2 Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, et al. A novel coronavirus assoc iated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med, 2003, 348(20): 1953

3 Marra MA, Jones SJ, Astell CR, et al. The genome sequence of the SAR S-associated coronavirus. Science. May 1, 2003, available from: http://www.sciencemag.org/cgi/rapidpdf/1085953v1.pdf

4 Parry J. SARS show no sign of coming under control. BMJ, 2003, 326(7394): 839

5 Parry J. SARS virus identified, but the disease is still spreading . BMJ, 2003 326(7395): 897

6 Drosten C, Gunther S, Preiser W, et al. Identification of a novel cor onavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med, April 10, 200 3. available from: http://content.nejm.org/cgi/reprint/NEJMoa030747v2.pdf

7 Poutanen SM, Low DE, Henry B, et al. Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada. N Engl J Med, Apr 10, 2003. available from: http://conten t.nejm.org/cgi/reprint/NEJMoa030634v3.pdf

(收稿日期：2003-05-28)