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临床样本DNA模板的常规制备方法
2003/10/26 0:19:24  飞捷生物
 

 

一、   病毒标本中提取DNA(支原体、腺病毒)处理方法

(1)将擦拭过的咽拭纸放入1.5ml装有1ml生理盐水的eppendorf管中。

(2)10,000r/min离心5分钟,去上清液。

(3)沉淀物加入30 ml TE液混匀后煮沸10分钟,4℃保存备用。

二、 从细菌中提取DNA

1NG(淋球菌)DNA的提取

标本可取自尿道、生殖道或结膜分泌物。

(1)取男性尿道口或女性宫颈处分泌物于事先加有1ml生理盐水的eppendorf管内。

(2)振荡棉签或拭纸使NG释放出来。

(3)10,000r/min离心5分钟去上清液,沉淀物加少许溶菌酶混匀,置37℃,保温30分钟。

(4)加入细胞裂解液至400μL,振匀之。

(5)将小管置60~65℃水浴消化2-3小时。

(6)加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(25241)混合液充分摇匀20分钟。

(7)10,000r/min离心5分钟,将上清液移入另一小管。

(8)加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA

(9)去乙醇,空气干燥后加入30μlTE液,置4℃冰箱保存备用。

2TB(结核杆菌)DNA的提取

临床标本可来源于痰、尿、支气管灌洗液、胸水、腹水、心包积液等。处理方法也不尽相同,除痰标本外,其他标本大致相同。注意痰标本的留取一定要取次日早上的晨痰,留存器皿要无菌消毒,避免污染。

1)痰标本TB DNA的提取

     挑少许痰液放入1.5mleppendorf管中,加入5mo1/L NaOH 500μl混匀,使痰液变稀,室温中摇动20分钟。

     加入1mo1/L NaH2PO4  600μl混匀(起中和作用),10,000r/min离心5分钟。

     去上清液,补加TE500μl混匀,加少许溶菌酶。

     37℃消化30分钟。

     加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25241)混合液,摇匀20分钟。

     10,000r/min离心5分钟,将上清液移至另一干净eppendorf管中,加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液,继续摇匀20分钟。

     10,000r/min离心5分钟,移上清液于另一小管中,加入等体积异丙醇摇匀。

     10,000r/min离心5分钟,去上清液,置空气中干燥,加入30μlTE溶解沉淀物,置4℃冰箱备用。

2)胸水、腹水、支气管灌洗液、尿液、心包积液标本TB DNA的提取

       将上述液体3ml,经反复离心,去上清液,留沉淀物。

       按上述痰标本处理操作步骤③-⑧提取。

三、组织内基因DNA的提取

1HPV(尖锐湿疣)提取

(1)取绿豆大小的组织样品于1.5mleppendorf管中,加入细胞裂解液少许,裂解液含0.1mo1/L NaC10.2mol/L蔗糖、0.01 mol/L EDTA0.3mol/L trispH8.0)和0.5%-1% SDS

(2)用眼科剪剪碎组织(越细越好),补足裂解液至400μl,并搅散组织块。

(3)60℃—65℃水浴消化2-3小时,中间摇匀两次。

(4)加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液抽提,摇匀20分钟。

(5)10,000r/min离心5分钟,上清液移入新的eppendorf管中,用两倍体积的乙醇沉淀DNA

(6)10,000r/min离心5分钟,去上清液,空气干燥沉淀物,加入30μlTE,置4℃保存备用。

2.各种肿瘤组织提取(胃、肠、心肌、骨骼肌、肝、腺癌、子宫、绒毛等)

(1)取绿豆大小的组织样品于1.5mleppendorf管中,加入细胞裂解液少许,每10ml裂解液含有:

1 mol/L Tris-HCl            0.1ml

0.5mol/L EDTA             2ml

5 mol/L NaC1              0.2ml

20% SDS                 1ml

200 μg/μl蛋白酶K       1ml

1 mol/L DTT               0.39ml

(2)用眼科剪尽量剪细组织块,补加细胞裂解液至500μl

(3)55~66℃保温2~3小时,中间摇匀两次。

(4)加入等休积的酚、氯仿、异戊醇混合液摇匀20分钟,10,000r/min离心5分钟。

(5)上清液移入新的eppendorf管中,加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液继续摇匀20分钟,10,000r/min 离心5分钟。

(6)上清液移入新的eppendorf管中,加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA

(7)挑出DNA,用70%乙醇洗两次,空气干燥,加适量TE溶解DNA(根据DNA量决定加入TE量),置4℃保存备用。

四、血标本DNA的提取

方法一:

(1)取抗凝外周血50μl,加入6mol/LNaI 50μl,混匀,振荡30秒。

(2)加等体积的氯仿、异戊醇混合液,振荡30秒。

(3)10,000~12,000r/min离心2~5分钟。

(4)取上清液移至新的eppendorf管中,加入异丙醇80μl混匀,至沉淀产生。

(5)12,000r/min离心3分钟,去掉异丙醇,37%异丙醇再洗一次,离心,去上清液,沉淀物干燥后(放室温),加入30μl无菌水溶解,置4℃保存备用。

方法二:

(1)10ml外周血,放于50ml管中,按1.3:10加入ACD抗凝。

(2)4,000r/min离心10分钟,去上清液。

(3)1.7%NH4Cl50ml,混匀,放37℃保温45分钟。

(4)4,000r/min离心10分钟,去上清液。

(5)加入50ml PBS液混匀,4,000r/min离心10分钟。

(6)去上清液,沉淀物中补加TE液至10ml,充分混匀。

(7)加入2.5ml 5mol/L NaClO4,混匀,加3ml 10%SDS混匀。

(8)55~60℃保温2~3小时。

(9)加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(25241)混合液摇匀40分钟。

(10)              4,000r/min离心10分钟,轻轻将上清液移入新的eppendorf管中。

(11)              2倍体积无水乙醇沉淀DNA,轻摇,挑出悬浮DNA放入新管中。

(12)              加入5 mlTE液,溶解后加50μl RNA(20mg/ml)

(13)              37℃温箱中保温1小时,加50μl 10%SDS100μl 20mg/ml的蛋白酶K120μl 0.5mol/LEDTA混匀,37℃过夜。

(14)              5ml TE液,混匀后加10ml 酚、氯仿、异戊醇(25241)混合液,混匀,放置40分钟。

(15)              4,000r/min离心10分钟,去上清液,加入2倍体积的无水乙醇,沉淀DNA,挑出DNA75%乙醇洗两次。

(16)              空气干燥后,加入适量TE溶解DNA,置4℃备用。

 

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