DNAfast5000
超量全血基因组DNA快速抽提试剂盒
保存条件：DD3液4℃保存，试剂盒其它部分室温保存，保质期1年。
技术支持：使用中遇到任何问题或建议，请通过E-mail（question@fastagen.com）与我们的技术支持部门联系，部门的资深分子生物学专家将在2个工作日内给予答复。
| 处理样本量 | 全血、骨髓2ml–10ml，细胞<5×107，组织<400mg |
| 步骤 | 裂解，分相，析出，清洗，干燥 |
| 耗时 | 50min |
| 最终溶解体积 | 100-500μl |
| 产量 | 30-50μg/ml全血，40-60μg/1×107细胞，50-100μg/100mg组织 |
| 纯度 | OD260/OD280: 1.7-1.9 |
| 片段长度 | 98%以上>48.5kb，大部分为100-200 Kb 高分子量基因组DNA |
| 特点 | 1. 单次处理多至10ml全血、400mg组织，单次提取可获得多至400μg DNA。 2. 全程常温操作，无需用Ficoll离心，无需Proteinase K消化，操作简便快捷，步骤少，耗时短。 3. 提取的DNA大部分为100-200 Kb 高分子量基因组DNA，纯度高，可以满足几乎所有的下游实验的苛刻要求。 4. 组织处理采用独创的网筛方法，快速方便，不需要另外准备匀浆器，或进行液氮处理，可以单次处理较大量的组织样本。 5. 可以完全提取细胞凋亡的DNA ladder，尤其是少量凋亡的小片断。 6. 方法稳定，每次提取都可以成功获得高质量DNA。 7. 提取的DNA稳定性高，可4℃保存6个月，-80℃长期保存。 |
| 用途 | 包括PCR, Southern Blot, RFLP, RAPD, Microsatelite analysis, HLA typing 等几乎所有下游实验。 |
试剂盒组成 ： ( Catalog no. 220042 100 次)
| DD1 | 500ml×4 |
| DD2 | 100ml |
| DD3 | 100ml |
| 洗液 | 500ml（已加有125ml） |
| 洗脱液 | 50ml |
| 无水乙醇 | 100ml（提供专用空瓶，待加入） |
| 15ml尖底离心管 | 100支（需要时另配） |
| 钢网，平皿，研磨棒 | 需要时另配（提取组织DNA时用） |
| 说明书 | 1份 |
操作流程：
实验操作前请先认真阅读“注意事项”
1. 取抗凝全血、骨髓2-10ml（样本中如有血凝块，应予去除），混匀后放入尖底离心管（7ml 以下用15ml管，7ml 以上用50ml管），加入等体积DD1液，拧紧管盖后颠倒混匀数次，室温放置5min。
2. 300g离心3min，小心倒去上清，留下底部沉淀（带有红细胞，约500μl-1ml），加入DD1液10ml，拧紧管盖后颠倒混匀数次，使底部沉淀全部散开。
3. 300g离心3min，倒去上清，管底留下液体约200μl，充分振荡混匀直至没有细胞团块。
4. 吸取细胞悬液，转移到5ml或15ml离心管中（如果细胞在15ml尖底离心管中，也可以不用转移）。
5. 加入DD2液1ml，以手腕充分用力振荡混匀10-20次，成为均一的裂解液，静置10min。
6. 加入DD3液1ml， 温和地翻转颠倒混匀10-20次，呈均质的乳糜状液体。
7. 离心3,000g，10min。小心吸取上层液体（注意不要搅动界面层）至新的离心管中，再加入2倍体积无水乙醇，立即颠倒混匀1min，使絮状DNA全部析出。
8. 离心3,000g，2min，倒去上清。
9. 加洗液2ml，震荡悬浮沉淀后，离心3,000g，2min，倒去上清。
10. 再重复此过程洗一次。
11. 倒去液体后，倒置在吸水纸上5min，然后真空冻干，或平放室温晾干15min左右。
12. 加入洗脱液100-500μl（或加入pH>7.0的水），轻轻吹打数次，溶解获得基因组DNA。
13. 提取的DNA可以放在4℃或-20℃保存，长期应在-80℃分装保存，避免反复冻融。
注意事项：
1. 除DD3液4℃保存外，试剂盒其它部分室温保存。保质期1年。
2. 应用普通水平离心机离心，也可以使用大型离心机，室温离心（注意：不要低温离心），避免急速刹停。以eppendorf 5810离心机为例，3,000g＝3,861rpm，300g ＝1,221rpm，其它类型离心机转速应达到相近的g数。
3. DD3液具有强烈腐蚀性，操作时要戴手套和防护眼镜，在通风柜中进行，若不慎沾染，立即用大量清水冲洗，必要时到门诊处理。用后拧紧瓶盖，置4℃保存。
4. 首次使用时在洗液瓶中加入375ml分析纯无水乙醇，用后拧紧瓶盖。另外提供一个空瓶，首次使用时倒满分析纯无水乙醇，在步骤7 使用。
5. 抗凝全血、骨髓采集后尽快提取，置4℃冰箱可以保存3-5天，超过7天则出现大量凋亡片断。也可以采集后置-20℃冻存，数月内提取对DNA质量影响不大。未抗凝的样本不能用于提取。
6. 组织的提取：先在平皿中加DD1液2ml/100mg组织，研磨组织通过钢网，收集过网悬液放入离心管中，后同步骤2-13。单次提取的组织量不能超过400mg。
7. 细胞的提取：步骤同3-13。单次提取的细胞量不能超过5×107。
8. 步骤2在底部沉淀全部散开后如留有血块，应先去处血块后进入下一步操作。
9. 如果样本量较小（如2-3ml全血），可以相应减少DD2、DD3的用量至500μl。
10. 加入DD2液后要用手腕充分用力振荡10-20次（不会引起DNA断裂），以确保样本完全溶解（样本未被充分裂解时可以见到有半透明的絮状物，粘滞度较高；充分裂解后为均匀透明的液体，粘滞度降低）。振荡不充分会导致DNA得率降低。
11. 加入DD3液后要温和地翻转颠倒混匀，用力振荡会导致DNA片段断裂。要求提取DNA的分子量越高，混匀时就越要轻柔缓慢，直至呈均质乳糜状液体。
12. 有时离心后出现界面上层液体混浊或呈白色固状，原因大多是A. 全血或骨髓样本预处理时残留红细胞及蛋白太多，应当在加入DD1离心后尽量吸净上清。B. 细胞或组织超量，应减少样本量。
13. 离心后用粗口吸管（普通1ml 加样枪头口太小，会切割DNA，剪去约5mm尖后即可）小心吸取上层液体，注意不要搅动界面层，如果吸入了界面沉淀物，应当舍弃。
14. 絮状DNA全部析出后也可以用加样枪头挑出放入另一1.5ml的eppendorf管中再清洗，可以方便实验操作。离心清洗后DNA贴壁不是很牢固，要小心吸弃上清，不要把DNA沉淀吸掉。
15. 采用倒置室温干燥或真空冻干去除DNA中残留的乙醇的方法，避免使用加热的方法。
16. 洗脱液pH<7.0时会明显降低DNA的溶解能力，而国内实验室用水大多呈偏酸性，自备洗脱液时应当注意。本试剂盒提供的洗脱液为pH7.6（10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA）。
17. 加入洗脱液100-500μl后获得基因组DNA会即刻溶解，可以轻轻吹打数次。如果产物较为粘滞，应适当补加洗脱液，或置60℃加热5min，促进DNA溶解。